2025 年 10 月 28 日，中国食品药品检定研究院（中检院）举办第 5 期 “妆评云课堂” 公益培训，系统解读化妆品替代方法相关标准，为行业合规发展提供权威指引。
什么叫替代方法？
1959年，欧洲两位科学家提到了关于动物福利三R原则的概念，即三个以R开头的英文单词：替代Replacement、减少Reduction和优化Refinement。替代是取代整体的动物实验，减少是减少动物的使用数量，优化是通过减少动物的痛苦来提高动物福利。从科学的角度来说，替代方法可以使用人源的细胞、皮肤组织等作为实验的材料，与人的相关性更高。此外替代方法具有高通量、操作便利、实验周期短、可重复性强等优势，可以提高检测的效率。
国际上目前普遍认可的替代方法都有哪些？
替代方法主要是OECD(经济合作与发展组织）发布的化学品测试指南中第4章的实验方法。OECD指南一共包含5个章节，其中只有第4章是针对人体健康评价的一些方法。目前这一章节详细介绍了92项指南，涵盖了符合优化或减少这两个R原则的替代实验方法，以及众多体外实验方法。特别地，它还包括了两个经过整合测试与评估策略性指导的文件。化妆品和化妆品新原料的注册备案中提供安评数据，可以通过采用OECD指南的方法进行检测来获取，例如透皮吸收试验等。
在我国化妆品标准体系当中，对国际上普遍认可的替代方法的标准转化工作：
我国参考了OECD的验证程序，对OECD指南中可用于化妆品的替代方法，以可转尽转的原则持续性地开展方法的确认和转化工作。OECD指南是推荐性质的，通常是在国外三家以上的GLP实验室开展。而我国化妆品安全技术规范是强制性的，在决定要不要纳入标准之前需要考察是否可以在大部分我国化妆品的注册备案、检验机构中实施。另外在考察的过程中还需要做很多前期的工作。首先是开展方法学评估，包括实验仪器、必需的耗材、试剂等。其次还要确认此方法是我国化妆品标准所需要采用的实验方法。最后会通过对化妆品安全技术规范持续的修订工作，来组织替代标准的修订。从立项到起草单位的遴选，全过程都是公开透明、有计划性的。
我国这些年在替代方法标准转化中的一些成果：
在2015版安全技术规范当中，新纳入了20项符合三R原则的替代方法，都是以国家局通告的形式动态调整然后纳入技术规范中的。这些替代方法包含了对传统动物实验的优化和减少的方法，比如在经口和吸入毒性、急性毒性实验组中的方法，包括固定剂量法、急性毒性分类法、上下增减剂量法等。此外，在皮肤致敏性评价中还纳入了两个小鼠局部淋巴结实验。也包含一些从体内实验向体外实验转变的半替代方法。
化妆品新原料备案注册可以使用动物替代试验吗？
在2024年7月8日，为了配合完整版的安评实施，中检院也发布了《化妆品新原料常见技术问答（二）》，为采用非动物实验提供了一些技术参考。
这个技术问答中关于毒理学方法选择有何要求说道：
根据《化妆品新原料注册备案资料管理规定》，新原料毒理学试验项目应当按照《化妆品安全技术规范》规定的试验方法开展。《化妆品安全技术规范》未规定方法的项目，应当按照国家标准或国际通行方法进行检验。
在进行化妆品新原料的毒理学安全性评价时，若采用动物替代方法，必须根据原料的结构特点和特定的毒理学终点，选择合适的整合测试和评估方法（IATA）来评价新原料的毒性。此外，如果所用的替代方法尚未被我国《化妆品安全技术规范》收录，该方法应为国际权威替代方法验证机构已收录的方法，并需提交该方法能准确预测毒理学终点的证明资料。所用动物替代试验方法尚未收录于我国《化妆品安全技术规范》的，该项替代试验方法应当为国际权威替代方法验证机构已收录的方法，且应当同时提交该方法能准确预测该毒理学终点的证明资料。证明资料应当包括该项替代试验方法研究过程简述和不少于10种已知毒性受试物的研究数据、结果分析、研究结论等内容。
替代实验是如何应用的？
单一的体外方法无法完全替代整体动物实验，通常需整合多个体外方法及其他来源的信息，由此形成了整合测试与评估策略，可借助AOP来设计该策略。目前在化妆品安全性评价领域已经成熟的研究是皮肤致敏性AOP的研究。下面就以皮肤致敏性评价为例系统介绍一下不同的评价方法。
OECD在2012年发布了关于皮肤致敏性有害结局通路(AOP)的指导性文件，其中明确指出皮肤致敏性是由一系列关键事件构成的，包括半抗原与皮肤蛋白质的结合、角质细胞的激活、树突状细胞的激活和抗原特异性T细胞的增殖。首先是化学物质与皮肤蛋白质结合，然后引起角质细胞的激活，再到树突状细胞的激活，再到抗原性、特异性T细胞的增殖，最终产生过敏性接触性皮炎这一有害效应。
在皮肤致敏性AOP指南中形成四个关键事件。OECD针对皮肤致敏性评估中的四个关键事件，开发了一系列替代方法，包括抗原与皮肤蛋白共价结合形成的起始事件、角质细胞炎性反应的细胞事件、树突状细胞摄取和呈递抗原的免疫细胞事件，以及淋巴结特异性记忆T细胞增殖的组织事件。比如关键事件1，皮肤蛋白和蛋白质的共价键合中，OECD推出了指南442C，包含三个具体的方法。针对关键事件2，角质形成细胞抗氧化通路的诱导，OECD推出了指南TG 442D，包含三个具体的方法。针对关键事件3，树突状细胞的激活，OECD推出了指南TG 442E，包括四个具体的方法。针对关键事件4，T细胞的活化与增殖，OECD早就有三个关于小鼠局部淋巴结实验的动物替代方法，分别是指南TG 429、442A/4442B。其中一些方法已经通过标准转化被纳入我国的安全技术规范当中。
什么叫3选2实验策略？
2024年发布的《皮肤致敏性整合测试与评估策略应用技术指南---3选2实验策略》。该指南旨在为我国开展完整版安评提供技术参考。
🔹一、为什么题目有“3选2试验”策略的副标题？
皮肤致敏性整合测试与评估策略是化妆品原料皮肤致敏性评价的工具之一，根据评估目的、整合的信息源、覆盖了哪些关键事件、评估程序、结果判定要求等因素的不同，可组成不同的“整合测试与评估策略”。基于我国化妆品行业现状，本次发布的“3选2试验”策略，基于皮肤致敏有害结局路径，整合关键事件KE1～KE3的试验形成策略，如直接多肽反应试验（DPRA）、角质细胞荧光素报告基因测试LuSens方法、人细胞系活化试验（h-CLAT）方法等。
🔹二、如何开展化妆品原料致敏性评价？
根据化妆品原料的特点，可选择如下三种方案的任意一种开展试验或文献检索获取试验结果，开展致敏性评价：（一）《化妆品安全技术规范》皮肤变态反应试验，包括局部封闭涂皮试验或豚鼠最大值试验；（二）《化妆品安全技术规范》皮肤变态反应：局部淋巴结试验，包括DA或BrdU-ELISA；（三）按照《皮肤致敏性整合测试与评估策略应用技术指南》的要求，选择相应的体外试验，根据“3选2试验”策略的原则得出结论；如无法判定原料致敏性风险，可选择（一）或（二）的方法进行评价。
🔹三、是否可以选用《化妆品安全技术规范》以外的试验方法？
如选用尚未收录于我国《化妆品安全技术规范》的其他国际权威替代方法验证机构发布的方法时，应说明方法适用性、检测的关键事件、结果判定及不确定性分析（如阈值边界范围等）。此外，在形成安全评估报告时，应遵循《化妆品安全评估技术导则》(2021年版)的要求，确保报告中明确记录评估方法的来源、毒理学危害识别的原理，并对评估结果的科学性、准确性和可靠性进行详细分析。用于化妆品新原料注册备案时，应符合《化妆品新原料注册备案资料管理规定》要求，同时提交该方法能准确预测该毒理学终点的证明资料。证明资料应当包括该项替代试验方法研究过程简述和不少于10种已知毒性受试物的研究数据、结果分析、研究结论等内容。
国内外创新技术都在快速发展，而我国的应用需要一个标准化的过程来保障科学规范地使用。
