在欧盟新型食品、饲料添加剂、食品添加剂等申报中使用微生物发酵工艺，并不能单凭“用了生产菌”这一点，直接判断是否必须提交全基因组测序（whole genome sequencing，WGS）资料。首先需要确认产品所属的监管类别、具体申报路径，以及适用的法规和专项指南。

在《用于支持食品链产品风险评估的微生物表征指南》框架下，如果非基因改造生产菌（non-GM production strain，以下简称‘非GM生产菌’）属于该指南的适用范围，微生物表征原则上应基于WGS开展，并应提供细菌的完整WGS数据。此时，WGS已不是单纯的附加检测，而是菌株分类鉴定、关注基因识别和后续安全性评价的重要基础。

至于WGS之后是否还需要开展最低抑菌浓度（MIC）、细胞毒性、抗菌活性、终产品活菌、生产菌DNA或特定有害物质检测，并不存在一套适用于所有非GM生产菌项目的固定组合。更合理的做法，是根据菌株所属物种、QPS状态、WGS分析结果、生产过程以及具体产品的监管要求逐步确定。

微生物发酵广泛用于食品添加剂、饲料添加剂、新型食品等产品的生产。发酵结束后，企业通常会通过分离、过滤、纯化等步骤去除生产菌，因此很自然会产生一个问题：既然生产菌并不打算留在终产品中，为什么申报时还需要花较大篇幅表征菌株本身？

EFSA 2025版微生物表征指南将“生产菌株（production strain）”定义为：通过包含微生物去除步骤的生产过程，产生目标物质或其前体的GM或non-GM微生物。也就是说，生产菌的特点恰恰是“参与生产，但原则上通过后续工艺被去除”。

该指南覆盖细菌、酵母、丝状真菌、微藻和其他原生生物，以及病毒和噬菌体等多个微生物类群。由于这些微生物在分类鉴定、WGS适用性、抗微生物药物耐药性以及毒力、产毒性和终产品验证方面差异较大，本文仅讨论非GM细菌作为生产菌（production strain）的典型场景。酵母、丝状真菌、微藻等需要另行逐案分析。

对于生产菌，EFSA 关注的不只是“最后有没有菌”，而是希望把菌株表征、危害识别（hazard identification）和终产品暴露（exposure）连成一条证据链：先确认实际用于生产的是哪一株菌，再识别这株菌是否具有需要关注的遗传或表型特征，最后结合生产过程和终产品数据，判断这些潜在危害是否仍可能形成实际暴露。

2025版指南所称的“关注基因（genes of concern）”，包括已知参与毒素、有害代谢物或治疗性抗微生物物质产生（常被称为抗菌活性）的基因、获得性治疗性抗微生物药物耐药基因，以及编码毒力因子的基因。这里的“关注”并不等于已经确认终产品存在安全风险，而是表示该遗传特征需要进入后续风险评估。

因此，“菌株存在某项危害（hazard）”与“终产品是否形成相应风险（risk）”需要区分。以获得性抗微生物药物耐药基因（acquired AMR gene）为例，如果生产菌携带此类基因，而终产品中既未检出生产菌DNA，也未检出活菌，按照2025版指南的评价逻辑，该遗传性hazard通常不会因终产品形成相应暴露。另一方面，毒素、有害代谢物或治疗性抗微生物物质即使在菌体和DNA已被去除后，仍可能残留于产品中，因此需要沿另一条证据链继续评价。

换句话说，评价的关键并不只是“生产菌有没有某项hazard”，还要进一步判断：该hazard能否到达终产品、是否形成exposure，并最终构成实际risk。

判断WGS是否需要开展，首先不能脱离具体产品类别和申报路径。

EFSA 2024版《有意用于食品链微生物全基因组序列分析要求声明》（下文简称“2024版WGS Statement”）明确说明，该文件的作用是规定WGS分析如何开展和报告，包括测序、质量控制、生物信息学分析以及数据提交等要求。它并不界定在哪些情况下WGS数据是必需的。申请人仍应根据产品性质核对相应的法规和领域专项指南（sector-specific guidance）。

在这一框架下，微生物表征通常应基于WGS分析。对于细菌，指南明确要求提供完整的WGS数据，并利用这些数据支持菌株分类鉴定、遗传改造表征（如适用）以及关注基因等安全性特征的分析。

因此，项目判断可以分成两个层面。第一层先回答“这个产品走什么监管路径、适用哪些法规和专项指南”。第二层再回答“在这一监管路径下，这株生产菌需要按照什么微生物表征要求准备资料”。如果非GM生产菌已经进入2025版指南的适用范围，那么完整WGS数据及相关分析就应作为菌株表征的重要基础资料来准备。

这里所说的WGS，也不宜理解为“一份写着全基因组测序的实验室报告”。真正能够支持申报的资料，至少应回答几个问题：受评菌株能否可靠鉴定到物种水平。完整基因组及质粒等染色体外遗传元件中是否存在关注基因。以及这些判断能否从原始数据、分析软件、参数、数据库和输出结果中得到追溯和复核。

换句话说，申报所需要的是一套能够支持风险评估的WGS数据包和分析链条，而不仅是一份结果摘要。

在讨论测序质量之前，更基础的问题是：测序、菌种保藏、生产和终产品检测所指的，是否始终是同一株申报生产菌。

2025版指南要求，微生物表征应基于实际接受评估的具体菌株。仅提供亲本菌株、原始菌株或同一开发谱系中其他菌株的数据，不能替代申报生产菌本身的表征资料。

申报菌株应保藏于国际认可的菌种保藏机构，并优先考虑欧盟境内的保藏机构。提交资料时，应提供相应保藏证明，其中包括有效发表的物种名称、菌株标识符和保藏编号等信息。

实践中比较容易出现的问题，是企业内部编号、工业生产编号、菌种保藏编号、实验室送样编号和WGS报告编号并不完全一致。遇到这种情况，建议通过菌株编号对应表或声明明确说明这些编号之间的关系。这个环节虽然简单，却直接影响审评人员能否确认后续数据确实来自申报菌株。

非GM也不意味着菌株开发历史可以省略。菌株来源以及开发过程中发生过的筛选、驯化、传统诱变等信息均应适当说明，并交代当前生产菌与原始菌株或亲本菌株之间的关系。对于开发时间较早、历史记录不够完整的菌株，更适合在项目早期确认现有资料能够支持到什么程度，而不是等到申报后再补追溯链。

用于WGS的样品应与实际申报生产菌保持一致。根据2024版WGS Statement，用于核酸提取和测序的纯培养物应从主细胞库获得。提取和分析范围应覆盖染色体以及质粒等染色体外遗传元件。对于细菌而言，这一点尤其重要，因为部分抗微生物药物耐药基因可能位于质粒或其他可移动遗传元件上。

对于细菌的测序策略，2024版WGS Statement的措辞比“通常建议”更明确：应采用长读长测序，或者短读长与长读长相结合的策略及混合组装方法。同时，文库构建和数据处理还应避免导致小质粒等遗传元件遗漏。

数据质量方面，WGS Statement对测序数据的碱基质量、测序深度、非预期reads等均提出了相应要求。对于申报而言，更重要的并不是单独满足某一个质量指标，而是确保最终数据能够支持可靠的完整基因组组装和后续分析。

对于细菌，还应提供完整组装的基因组，并说明采用何种方法确认组装的完整性。这里的重点并不只是“测得足够深”，而是最终数据是否能够完整覆盖后续需要评价的遗传信息，包括染色体外元件。

菌株的分类鉴定也应基于WGS，而不能只依赖16S rRNA序列或传统生化鉴定。对于细菌，2024版WGS Statement优先推荐使用数字DNA-DNA杂交（dDDH）和/或平均核苷酸一致性（ANI），并将申报菌株与预期物种的模式菌株以及多个近缘物种模式菌株进行比较。

申报时还应按照2024版WGS Statement的要求提供相应的原始和处理后测序数据、组装序列及必要的分析文件，并记录分析使用的软件、版本、参数以及数据库版本或访问日期，使主要结论能够被追溯和复核。

2025版指南进一步要求，申请提交时所采用的生物信息学分析原则上不应超过2年，并应使用持续维护或经过整理的数据库。（这里需要区分“原始测序数据产生时间”和“生物信息学分析时间”：这一时效性要求针对的是分析结果，并不意味着菌株需要每两年重新取样和重新测序。）

完成菌株鉴定和合格WGS数据只是起点。下一步需要结合菌株所属物种、QPS状态以及基因组分析结果，判断还存在哪些需要进一步回答的安全问题。

合格安全资格（Qualified Presumption of Safety，QPS）是 EFSA 针对具有充分安全知识基础的特定微生物分类单元建立的评价方式。只有菌株属于最新QPS清单中的分类单元，并满足相应的全部qualification，才能采用这一评价路径。QPS可以减少部分安全性资料要求，但不会免除可靠的菌株身份确认和相应qualification的验证。

例如，部分芽孢杆菌属（Bacillus）及相关分类单元具有“无产毒活性（absence of toxigenic activity）”的限定条件（qualification），需要按照指南要求通过相应细胞毒性试验进行验证。因此，“细胞毒性试验要不要做”并不是所有细菌项目都得到同一个答案，而需要看菌种和具体QPS qualification。

抗微生物药物耐药性（antimicrobial resistance，AMR）的评价通常首先从WGS筛查开始。对于细菌，应对完整基因组——包括染色体外遗传元件——检索与人用或兽用治疗性抗微生物药物有关的耐药基因，并至少使用两个持续维护或经过整理的AMR数据库进行分析。

发现AMR基因命中后，还需要区分它属于该物种的固有基因（intrinsic）还是获得性基因（acquired）。如果有充分依据证明该基因为该物种固有，指南认为其不构成相应关注，通常无需继续围绕该基因补充资料。

如果该基因属于获得性AMR基因，或者现有证据不足以确认其属于固有基因，则需要针对其可能影响的抗微生物药物开展最低抑菌浓度（MIC）试验，并与适用的微生物学截断值（cut-off）比较。

对于生产菌，MIC高于适用cut-off表明存在相应的耐药表型，在指南的框架下首先被视为菌株层面的hazard。是否进一步构成终产品的risk，还需要结合终产品中生产菌及其DNA的暴露情况判断。即使MIC未显示相应耐药表型，也不能简单将WGS中发现的AMR基因解释为“没有意义”，仍需结合基因序列、完整性和已知功能等信息逐案分析。

生产治疗性抗微生物物质的能力则属于另一项评价。对于不满足QPS、已知可能产生相关抗微生物物质，或者QPS qualification涉及抗微生物物质产生的菌株，2025版指南要求结合WGS分析和表型试验进行评价。

WGS应检索与治疗性抗微生物物质生物合成有关的基因或基因簇。必要时，再通过表型试验评价菌株或发酵产物是否表现出相应的抑菌活性。

WGS应检索与治疗性抗微生物物质生物合成有关的基因或基因簇；同时，应按照指南要求开展相应的抑菌活性表型试验。如果观察到抑菌现象，需要进一步明确其性质，以排除治疗性抗微生物物质所致的活性。若基因组分析检出与治疗性抗微生物物质生物合成相关的基因或基因簇，还应进一步对相关抗微生物物质的可能存在进行定量分析；对于生产菌，评价对象通常为终产品。

毒力、产毒性和有害代谢物的判断同样不是看到一个数据库命中就结束。对于不在QPS清单内的菌株，应基于较新且充分的文献资料评价该菌株、所属物种和近缘分类单元的产毒性、致病性和使用历史。对于细菌，还应通过WGS检索已知毒力因子及有害代谢物相关基因。

这些基因组结果、物种知识和文献证据可能进一步触发表型试验或终产品分析。对于知识基础有限的物种，也可能需要额外的文献或实验资料。芽孢杆菌属（Bacillus）、蜡样芽孢杆菌群（Bacillus cereus group）、部分肠球菌属（Enterococcus）等则存在更加具体的评价路径，不宜只按一套通用流程处理。

因此，从项目设计角度，与其一开始就把MIC、细胞毒性、抗菌活性和各种代谢物分析全部打包，更合理的顺序通常是：先固定菌株身份并完成WGS，再判断QPS和关注基因，之后根据实际结果确定哪些表型试验和终产品分析确有必要。这样更容易让每项检测都有明确的风险评估目的。

申报资料与其按照“做了哪些实验”排列，不如按照“风险评估需要回答哪些问题”来组织。这样更容易让审评人员看到不同数据之间的关系。

第一部分是菌株身份和来源。核心是证明实际生产菌是谁，包括有效物种名称、保藏信息、各类内部及外部菌株编号之间的对应关系，以及菌株来源和必要的开发历史。

第二部分是WGS数据及分析。除测序报告外，还应能够提供核酸提取和文库构建信息、测序策略和质量控制、完整基因组组装及其完整性验证、原始数据和相关分析文件，以及软件、参数和数据库信息。

第三部分是菌株安全性表征。这里将分类鉴定、QPS、AMR、毒力、产毒性、抗微生物物质和有害代谢物等信息串联起来，并根据WGS或物种知识实际触发需要的MIC、细胞毒性或其他实验。

第四部分再进入生产工艺和终产品。生产过程说明菌体及相关危害如何被控制。终产品数据则根据具体项目分别回答是否仍有活菌、是否存在生产菌DNA，以及是否有需要关注的毒素、有害代谢物或治疗性抗微生物物质。

从项目推进顺序看，更值得优先做的是确认欧盟监管路径和适用指南，固定并保藏实际生产菌，核对主细胞库、工业生产编号、送样编号和保藏编号之间的关系，再评价已有WGS数据是否满足现行要求。完成分类鉴定、QPS判断和关注基因筛查之后，再决定后续表型试验和终产品检测项目，通常会比“所有试验一起做”更有效率。

还需要尽早考虑样品问题。终产品试验可能涉及独立发酵批次和工业规模样品，如果在WGS和菌株评价全部结束后才开始寻找合适批次，往往反而会成为项目时间上的瓶颈。

如果项目已经进入2025版微生物表征指南针对生产菌（细菌）的适用范围，完整WGS数据和相应分析就应作为菌株表征的重要基础。后续需要做什么，则应继续沿着“菌株身份确认→WGS表征→hazard identification→必要的表型验证→终产品exposure/risk assessment”这一逻辑展开。

对企业而言，比“我们以前做没做过WGS”更值得提前确认的是：这套数据是不是来自真正的申报生产菌，是否满足当前的测序和组装要求，是否覆盖染色体外遗传元件，以及这些分析能否真正支持后续安全性评价和终产品检测设计。

但到了实际项目中，真正困难的往往不是理解这条总体逻辑，而是判断具体做到哪一步才足够。尤其是在企业已经有部分历史数据、WGS出现某些命中，或者生产工艺已经能够去除菌体的情况下，下一步是否需要补充试验，往往需要结合具体项目逐案判断。

例如：

🟠 企业已经有一套基于Illumina平台完成的WGS数据，在现行EFSA要求下还能不能继续使用？是需要全部重新测序，还是补充Nanopore、PacBio等long-read数据即可？

🟠 已有Illumina数据如果要与long-read数据进行hybrid assembly，需要满足哪些前提？历史数据中的菌株来源、原始reads、测序质量和样品一致性会不会影响其可用性？

🟠 WGS生物信息学分析发现AMR gene hit后，应如何判断它是intrinsic还是acquired？什么情况下需要进一步开展MIC试验？

🟠 对于non-GM production strain，什么时候需要检测终产品中是否存在生产菌活菌？具体监管路径会如何影响这一要求？

🟠 non-GM production strain在什么情况下需要检测终产品中的生产菌DNA？如果发现genes of concern，检测要求会发生什么变化？

🟠 WGS发现一个biosynthetic gene cluster（BGC），下一步应该如何判断？什么时候只需要进一步分析其功能，什么时候需要开展表型验证，什么时候又必须进一步检测终产品中的相关代谢产物？

这些问题背后，其实都回到同一条主线：监管路径→菌株身份/WGS→hazard identification→必要的表型验证→终产品exposure/risk assessment。只有结合具体菌株、WGS结果、生产过程和产品监管路径，才能判断哪些数据已经足够、哪些还需要进一步补充。

本次webinar由ZMUni中贸合规中心与BaseClear联合举办。BaseClear总部位于荷兰莱顿生物科学园（Leiden Bio Science Park），拥有30余年的基因组学专业经验，并长期服务于食品、饲料及食品配料领域，在微生物全基因组测序（WGS）、菌株安全性表征、质量与安全检测以及EFSA等法规申报支持方面具有丰富经验。

上述问题，也正是我们将在本次ZMUni中贸合规中心 × BaseClear webinar中结合实际案例重点讨论的内容。