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根据《皮肤致敏性整合测试与评估策略应用技术指南》（征求意见稿），皮肤致敏性整合测试与评估策略基于皮肤致敏有害结局路径（Adverse Outcome Pathway，AOP）以及针对其中各关键事件（Key Events，KEs）研发的系列替代毒理学试验，整合待评估原料相关数据进行证据权重分析，对化妆品原料潜在的皮肤致敏性风险进行评价。

皮肤致敏AOP示意图

在皮肤致敏性AOP中，关键事件KE1为分子起始事件，关键事件KE2和KE3分别为角质形成细胞应答和树突状细胞应答，关键事件KE4为组织器官反应（淋巴T细胞增殖）。

采用皮肤致敏性AOP检测关键事件KE1—KE3的毒理学试验方法组成“3选2试验”策略，其适用范围应符合所选所有试验方法适用性的要求。“3选2试验”策略应从KE1—KE3中任意选择两个关键事件，分别选择相应的替代方法对两个关键事件进行检测，如两项试验结论一致且试验结果均不在阈值边界范围内，则根据一致的结论判定化妆品原料是否具有皮肤致敏性；否则选择第三项关键事件相应的替代方法开展检测，根据三项试验中两项一致的试验结论判定化妆品原料是否具有皮肤致敏性；若三项试验结论存在矛盾（一项为阳性结果、一项为阴性结果、一项结果在阈值边界范围内）或其中两项以上试验结果均在阈值边界范围内，则判定无法确定皮肤致敏性风险。

《规范》中用于检测皮肤变态反应的方法包括：皮肤变态反应试验、皮肤变态反应：局部淋巴结试验（DA）、皮肤变态反应：局部淋巴结试验（BrdU-ELISA）、化妆品用化学原料体外皮肤变态反应：直接多肽反应试验、体外皮肤变态反应人细胞系活化试验、体外皮肤变态反应氨基酸衍生化反应试验、体外皮肤变态反应 U937细胞激活试验方法。体外皮肤变态反应ARE-Nrf2荧光素酶LuSens试验方法也已经公示征求意见稿。

其中皮肤变态反应试验、局部淋巴结试验均使用动物（豚鼠、小鼠）进行试验；直接多肽反应试验方法和氨基酸衍生化反应试验方法针对皮肤变态反应中的第一个关键分子事件进行检测；LuSens试验方法是针对皮肤变态反应中的第二个关键分子事件进行检测。人细胞系活化试验针对皮肤变态反应中的第三个关键分子事件进行检测。动力学直接多肽反应试验也是针对皮肤变态反应中的第一个关键分子事件进行检测，试验原理与直接多肽反应试验方法和氨基酸衍生化反应试验一致，但可以提供化合物皮肤致敏性亚类分级。该方法可以应用在皮肤致敏评价的整合策略中，用于化妆品原料的风险评估，并进一步提高替代试验方法的准确性和特异性。

本研究建立了皮肤变态反应的替代试验方法，以期与国际标准接轨，与《化妆品安全技术规范》中皮肤变态反应检测方法在技术上形成互补，建立我国动物实验替代方法体系，增补、修订和完善现有的标准与规范方法以及促进我国未来的化妆品安全评价体系提供技术支持。

1️⃣ 适用范围：

本方法规定了动力学直接多肽反应试验的基本原则要求和方法。

本方法用于化妆品用原料的安全性毒理学检测，适用于单一成分物质、已知成分及含量的多成分物质和混合物的潜在皮肤致敏性评价。

⭕特殊化合物的适用性

金属化合物可通过共价结合以外的机制与蛋白质发生反应，该方法不适用于金属化合物。此外，kDPRA仅测量与半胱氨酸肽的反应性，不适用于具有赖氨酸专属反应性的强致敏剂，如一些酰基卤化物、酚酯或醛类等。

2️⃣ 试验目的：

预测和评价化妆品用化学原料是否具有潜在的皮肤致敏性。

3️⃣ 试验原理：

该试验基本原理同直接多肽试验（DPRA），有致敏性的受试物与多肽模拟的皮肤蛋白（本试验仅使用半胱氨酸多肽）共同孵育，导致多肽量减少。不同于DPRA仅测试化学物质一个浓度和一个时间点，kDPRA以时间和浓度依赖的方式量化评价被测物质的多肽结合反应性。被测物质采用5个浓度与半胱氨酸多肽溶液孵育不同时间（6个时间点）后，通过添加单溴二胺（Monobromobimane, mBrB，CAS 74235-78-2）与未结合的半胱氨酸多肽形成荧光复合物，来测量多肽的剩余量。如某时间点未结合多肽百分比的自然对数与受试物浓度呈线性关系（准一级反应），则通过斜率绝对值求得反应速率常数k，换算成对应时间点的反应动力学常数kt（单位：M-1s-1），并计算各时间点lgkt，以其中最大值lgkmax进行结果判断评价受试物的皮肤致敏性。

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