2025年11月14日，国家药监局发布《关于深化化妆品监管改革促进产业高质量发展的意见》，其中第二十三条明确提出“加快推进动物试验减免，遵循减少、代替、优化原则”。2026年7月，国家药监局发布《关于化妆品注册备案有关事项的公告（2026年第70号）》，明确非氧化型染发产品、仅具物理遮盖作用的祛斑美白产品，以及使用了新原料的普通化妆品（儿童化妆品除外） 可免于提交毒理学试验报告。
从政策导向来看，化妆品动物试验的替代工作已进入加速推进阶段，相关法规和技术体系正在逐步完善。但很多从业者仍有困惑：替代方法到底有哪些？怎么选？怎么用？本文梳理中检院《化妆品原料局部毒性评价新方法》专题讲座核心内容，一文讲透五大局部毒性终点的替代方法体系。
所谓“新方法”（New Approach Methodologies，NAMs），指的是遵循三R原则（减少、替代、优化），以不良结局通路（AOP）为框架的体外模型、化学分析、计算毒理等技术的整合。
简单来说，这是一套从“用动物看结果”到“用机制推结论”的范式转变——不再是简单地用动物替代方法1:1替代动物实验，而是建立一套全新的、基于人体生物学机制的证据体系。
三R原则：减少（Reduce）——在保证信息量的前提下把动物用量降到最低；替代（Replace）——用无知觉材料替代有知觉的动物；优化（Refine）——优化饲养和实验步骤，减少非人道程序的影响。
国际趋势也在加速推进。目前全球已有47个国家和地区禁止在化妆品实验中使用动物。2025年5月，欧盟委员会宣布计划最迟于2026年第一季度前最终确定“无动物试验”路线图。2026年6月1日，欧盟进一步发布路线图，将替代进程从化妆品领域推向整个化学品领域。
国内方面，2026年7月，国家药监局发布《关于化妆品注册备案有关事项的公告（2026年第70号）》，进一步明确动物试验减免范围。监管思路已经从观望跟随转向主动推进。
局部毒性是目前替代方法最成熟、最能落地的领域。以下逐一介绍：
框架文件：OECD GD 203
核心方法：TG 439 重建人体表皮试验（RHE）
该方法利用组织工程学，以人源非永生化的角质形成细胞为基础，在气液界面上诱导分化，构建与原生表皮高度相似的三维模型（含基底层、棘层、颗粒层和功能性角质层）。受试物涂在模型表面，敷浴后用MTT比色法测定线粒体脱氢酶活性，量化组织细胞活力，以此判断是否具有皮肤刺激性。该方法的最大优势是直接预测人体反应，无需再做种属外推。适用于TG 439的模型需经过3家权威实验室验证，对20个参考化学品做3次以上有效测试，灵敏度≥80%、特异性≥70%、准确度≥75%。
分类对接GHS：皮肤腐蚀分为1A/1B/1C（严重度递减），皮肤刺激分为Cat.2，轻度刺激为Cat.3。
方法体系汇总：
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TG 430 化妆品用化学原料离体皮肤腐蚀性大鼠经皮电阻试验
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TG 439 体外皮肤刺激性：重建人体表皮试验方法
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框架文件：OECD GD 263（2023年版）
眼刺激性评价的GHS分类为三档：Cat.1为严重损伤（腐蚀），Cat.2为眼刺激（2A为7天内可逆，2B为7天内不可逆），其余为未分类。
主要体外方法：
2025年重要更新：OECD于2025年6月发布了56项新/更新测试指南，其中包括TG 467眼刺激领域的定义方法指南修订，扩展了适用范围以包含表面活性剂。TG 467将方法组合标准化，按受试物类型选择不同策略：非表面活性剂液体使用DAL-1或DAL-2，固体使用DAS，表面活性剂使用专用DSF方案。每种组合都有固定的数据解释规程，直接输出GHS分类结论。
方法体系汇总：
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TG 491 兔角膜上皮细胞短时暴露试验；TG 460 荧光素渗漏试验方法；TG 437 牛角膜渗透性通透性试验方法
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化妆品用化学原料体外兔角膜上皮细胞短时暴露试验；化妆品用化学原料荧光素渗漏试验方法；牛角膜渗透性通透性试验方法
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框架文件：OECD GD 256
皮肤致敏是局部毒性中机制研究最深入的领域，AOP链条非常清晰，也是定义方法最成熟的终点。
AOP四个关键事件（KE） ：
我国的“三选二”策略：从KE1到KE3中选两个关键事件的实验结果，一致即可判定；不一致则需补充第三个关键事件的实验，取两次一致的结果判定。
目前《化妆品安全技术规范》已收录的皮肤致敏替代方法包括：DPRA、ADRA、h-CLAT、U-SENS和LuSens方法。
效力分级：识别出致敏物后，还需进行GHS效力分级——GHS 1A为强致敏物（EC3≤10μg/cm²），GHS 1B为中弱致敏物（EC3在10~1000之间）。
方法体系汇总：
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TG 442A 皮肤变态反应：局部淋巴结试验（LLNA）；TG 442B 局部淋巴结试验：BrdU-ELISA / FCM；TG 442C 直接多肽反应试验（DPRA）/ 氨基酸衍化反应试验方法（ADRA）/ 动力学直接多肽反应试验（kDPRA）；TG 442D ARE-Nrf2 荧光素酶 LuSens 试验方法；TG 442E 人细胞系活化试验（h-CLAT）/ U937 细胞激活试验（U-SENS）
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皮肤变态反应：局部淋巴结试验 DA；皮肤变态反应：局部淋巴结试验 BrdU-ELISA；皮肤变态反应：局部淋巴结试验 LLNA-FCM；化妆品用化学原料体外皮肤变态反应：直接多肽反应试验；体外皮肤变态反应 氨基酸衍化反应试验方法；动力学直接多肽反应试验方法（kDPRA）；体外皮肤变态反应 ARE-Nrf2 荧光素酶 LuSens 试验方法；体外皮肤变态反应 人细胞系活化试验方法；体外皮肤变态反应 U937 细胞激活试验方法
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框架文件：OECD GD 397
光毒性的特殊性在于需要“化学物质+光照”两个条件同时成立，评价从光吸收筛查开始。
光毒性AOP四步：
分子起始事件：物质吸收290-700nm紫外可见光
分子被激发：通过Ⅰ型或Ⅱ型光化学反应产生活性氧（ROSS）
关键事件：ROS攻击脂质/蛋白/DNA引发细胞损伤
不良结局：皮肤光毒性（光刺激皮炎）
评价流程（三层决策） ：
第一层初筛：OECD TG 101（紫外可见光谱）或TG 495（ROS检测），二者有一者为阴性无需后续实验
第二层细胞验证：TG 432（3T3中性红摄取）或TG 498（重建人表皮光毒性），二者有一者为阴性无需后续实验
第三层暴露校正（可选）：TG 427/TG 428皮肤吸收试验
TG 498的优势在于具有角质层屏障，可耐受UVB照射，更加贴近人体的实际使用场景，也适用于配方及难溶物的检测。
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TG 432 体外3T3中性红摄取光毒性试验方法；TG 495 光反应性活性氧（ROS）测定试验方法
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化妆品用化学原料体外3T3中性红摄取光毒性试验方法；光反应性活性氧（ROS）测定试验方法
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框架文件：OECD TG 428
皮肤吸收评价的目的是预测化学原料在离体皮肤中的经皮吸收率。吸收率直接决定安全边际值（MoS值）的大小。
《化妆品安全评估技术导则》（2021年版）取值规则：
无透皮吸收数据：吸收率按100% 计（最保守默认值）
满足部分条件（分子量＞500Da、log P≤-1或≥4、TPSA＞120Ų、熔点＞200℃）：吸收率可按10% 计
结构稳定聚合物（平均分子量＞1000Da，低聚物含量＜1%）：可不考虑透皮吸收
注意：吸收率不按100%计时，需要提供有关情况的说明。
体外实验流程：准备皮肤（首选巴马小型猪，厚度0.5-1.0mm）→安装扩散池→涂抹样品→达到暴露时间后清洗→分别收集角质层/表皮/真皮/接收液计算吸收率。
化妆品原料局部毒性评价正处于从动物实验向非动物替代方法转型的关键阶段。国际层面，欧盟已率先完成化妆品领域的动物试验禁令，并于2026年6月将替代进程延伸至整个化学品领域；国内层面，2025年11月国家药监局明确提出“加快推进动物试验减免”，2026年7月进一步扩大豁免范围，监管思路已从观望跟随转向主动推进。
在方法体系方面，五大局部毒性终点均已建立“框架文件+定义方法+证据权重”的完整技术体系，其中皮肤致敏性基于AOP机制最为成熟，皮肤刺激/腐蚀性和眼刺激/腐蚀性已形成模块化整合测试策略，皮肤光毒性和皮肤吸收也建立了成熟的体外评价方法。2025年6月OECD发布56项新/更新测试指南，2025年8月国家药监局将5项替代方法纳入《化妆品安全技术规范》，方法体系日趋完善。
总体而言，化妆品原料局部毒性评价的技术路线已从单一的动物实验转向机制化、组合化、计算化的NAMs证据体系，相关方法的选择应遵循《化妆品新原料注册备案资料技术通则》的五级要求，确保评价结论的科学性、合规性与国际互认性。
*内容来源: 本文内容整理自中国药品检定研究院所属中检云课平台发布的网络培训课程《化妆品原料局部毒性评价新方法》
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